Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi kullanılarak ayırma, analitin mobil faz (eluent) ile sabit faz arasında dağılımına dayanır. Numunenin bir bileşeninin molekülleri ile paketleme materyali arasındaki spesifik moleküller arası etkileşimler, aslında bu moleküllerin durağan faza geçişli olarak alınmasına neden olur. Sabit faz ile etkileşim mobil faz ile karşılaştırıldığında ne kadar büyük olursa, durağan faz ile etkileşimde harcanan süre o kadar uzun, sütun üzerinde harcanan süre o kadar uzun ve o bileşen için tutma süresi o kadar uzun olur. Tekniğin gücü, ayrımların ince ayarını yapmak için kullanılabilecek çok çeşitli mobil ve sabit fazlardan gelir.

Farklı paketleme malzemeleri farklı ayırma mekanizmalarını destekler - normal faz, ters faz, boyut dışlama, iyon değişimi, afinite, kiral veya hidrofilik etkileşim HPLC. Normal fazlı LC, bir polar sabit faz ve daha az polar olan veya olmayan bir eluent kullanır. Ters fazlı LC'de bu polariteler tersine çevrilir.